PCR Polymerase Chain Reaction

PCR (Polymerase Chain Reaction) o reacción en cadena de la polimerasa. 

Es el método más utilizado para la amplificación y obtención de múltiples copias de una secuencia de ADN.

Historia

Esta técnica, imprescindible hoy en cualquier laboratorio, fue inventada por Kary Mullis en 1986. Fue una técnica realmente revolucionaria ya que permitía realizar la amplificación in vitro de muestras de ADN excepcionalmente pequeñas, sin necesidad de una transferencia previa a células vivas (clonación in vivo).
Entre sus aplicaciones en medicina destacan en medicina legal, para la identificación de individuos a partir de muestras biológicas, diagnóstico prenatal de enfermedades de origen hereditario, pruebas de paternidad, etc.

Fundamento

La técnica se fundamenta en la propiedad natural de las enzimas ADN polimerasas de replicar el ADN. Para ello, el fragmento de ADN molde que se quiere amplificar, se acompaña por dos cebadores o primers, es decir, dos secuencias de oligonucleótidos que son reconocidos por la ADN polimerasa termorresistente como "localizadores" del inicio y fin del tramo de ADN que deben copiar. Durante cada ciclo, se alternan altas y bajas temperaturas que tienen como objetivo separar las hebras de ADN recién formadas para dejar que vuelvan a unirse y duplicarse nuevamente.

En cada ciclo del proceso se aumenta de forma exponencial la cantidad de ADN. Una vez completado el procedimiento es posible visualizar el fragmento de ADN amplificado mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de ADN en geles de agarosa.

Los componentes del sistema son:

Tampón: Solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la Taq polimerasa.

DNA molde

Oligonicleótidos (cebadores): secuencias de oligonucleótidos que son complementarias a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la Taq polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

Polimerasa termoestable (Taq polimerasa): Enzima que sintetiza ADN a partir de la hebra molde de la muestra. Procede del microorganismo Thermus aquaticus

Cationes divalentes en forma de dicloruro de magnesio (MgCl2) que actúan como cofactores de la Taq-polimerasa

dNTP (Desoxinucleótidos trifosfato): Sustrato para polimerizar las nuevas hebras de ADN

Kit de laboratorio PCR: https://www.3bscientific.es/reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa,p_1151_5643.html

*En la página que se enlaza a continuación encontrarás más información (tipos, precios, especificidad y sensibilidad, etc.) sobre algunos de los kits de laboratorio disponibles en el mercado para realizar PCR: http://www.jenabioscience.com/images/dcf5572fa4/MolecularBiologyBrochure.pdf

Etapas de la PCR 

Desnaturalización de la hebra molde de ADN alrededor de 94ºC de temperatura entre 1 y 9 minutos. ¿ De qué factores dependerá la temperatura y el tiempo que se mantenga durante la desnaturalización de la hebra de ADN?https://drive.google.com/file/d/0Byz6Z5jvaCQcOVhDanpmV0o5b2s/view?usp=sharing

Hibridación a temperaturas de entre 35 - 60ºC durante 20-40 segundos, que permiten que los cebadores se unan por complementariedad de bases a la hebra molde

Elongación o extensión, la enzima Taq-polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3' libre de la región en la que han hibridado los cebadores a temperatura alrededor de los 72ºC. El tiempo de esta fase depende, entre otros, de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar, aunque normalmente se establece la premisa de que la ADN polimerasa polimeriza mil bases por minuto en su temperatura óptima.

Elongación final: Durante los 5 - 15 minutos tras el último ciclo de PCR, se mantiene la temperatura a 70-74ºC para asegurar que cualquier cadena de ADN simple restante sea totalmente ampliado.

El técnica se completa realizando entre 25-35 ciclos.

Materiales

TermocicladorMicropipetas y puntasTubos Eppendorff

Conceptos de la PCR

Sensibilidad: Hace referencia a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación y el resultado pueda ser interpretado. Está relacionada con los falsos negativos debido a que una muestra positiva puede ser dada como negativa si no hay suficiente cantidad de ADN para amplificar.

Especificidad: Viene determinada por la especificidad con la que se unan los oligonucleótidos a la hebra de ADN molde, de forma que si se unen a otros fragmentos del ADN además del que queremos amplificar, obtendremos más de un producto amplificado, por lo que se relaciona con los falsos positivos. Una muestra que sea negativa puede darse por positiva porque se haya amplificado una región del ADN que no era la que se buscaba amplificar.

Eficiencia: Amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.

Fidelidad: Hace referencia a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. Una buena fidelidad evita falsos positivos y/o negativos.